色譜及質(zhì)譜檢測中往往需要對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定量，目前使用較多的定量方法有面積歸一化法、單點(diǎn)校正法、外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法、標(biāo)準(zhǔn)加入法等。

定量分析基本要求：

1、純物質(zhì)做標(biāo)準(zhǔn)

2、被定量組分峰要與其它峰達(dá)到基線分離（質(zhì)譜可不滿足）

3、符合定性參數(shù)要求

4、選擇合適的定量方法

定量分析基本公式：

在某些條件限定下，被測組分濃度與檢測器的響應(yīng)值成正比關(guān)系。（蒸發(fā)光散射檢測器濃度與峰面積不成線性，分別取對(duì)數(shù)后成線性）

C_i=f_iA_i或C_i=f_iH_i

C_i：組分濃度

f_i：響應(yīng)因子（與組分的理化性質(zhì)和檢測器的性質(zhì)有關(guān)）

A_i：組分響應(yīng)面積

H_i：組分響應(yīng)高度

實(shí)際修飾公式：Y=aX+b

一、面積歸一化法

把所有出峰的組分含量之和按100％計(jì)的定量方法，稱為歸一化法。當(dāng)樣品中所有組分均能流出色譜柱，—并在檢測器上都能產(chǎn)生信號(hào)的樣品，可用歸一化法定量，其中組分i的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可按式計(jì)算:

歸一化法定量的主要問題是質(zhì)量校正因子的測定較為麻煩，雖然一些校正因子可以從文獻(xiàn)中查到或經(jīng)過一些計(jì)算方法算出，但要得到準(zhǔn)確的校正因子，還是需要用每一組分的基準(zhǔn)物質(zhì)直接測定。

氣相色譜的一些主要檢測器如FID和TCD對(duì)某些組分，如同系物的校正因子相近或有一定的規(guī)律，從文獻(xiàn)中可以查到或進(jìn)行計(jì)算。當(dāng)校正因于相近時(shí)，可直接用峰面積歸一化進(jìn)行定量分，例如下表中給出了C8芳烴異構(gòu)體的分析結(jié)果。四個(gè)組分的FID檢測器的質(zhì)量校正因子在0.96-1.00之間，結(jié)果給出了用校正因子進(jìn)行歸一化法的定量結(jié)果和直接用峰面積進(jìn)行歸一化的定量結(jié)果。

比較兩個(gè)結(jié)果，誤差很小。在這種情況下直接用峰面積歸一是十分方便的，也是誤差范圍所允許的。

用 途：

用于雜質(zhì)檢查時(shí)，由于峰面積歸一化法測定誤差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量。

除另有規(guī)定外，一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查。不能作為準(zhǔn)確定量的方法，僅在特定情況下使用。

特 點(diǎn)：

1、無需校正（無標(biāo)準(zhǔn)曲線）

2、進(jìn)樣量不嚴(yán)格要求

3、要求所有組分都流出并且被檢測到

4、要求所有組分的響應(yīng)因子相當(dāng)

5、FID用的較多，校正響應(yīng)差異

6、假設(shè)所有fi均相同則

Wi%=mi/(m1+m2+m3+…+mi+…)*100%==Ai/(A1+A2+A3+…+Ai+…)*100%=Ci%

二、外標(biāo)法

用待測組分的純品作對(duì)照物質(zhì)，以對(duì)照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應(yīng)信號(hào)相比較進(jìn)行定量的方法稱為外標(biāo)法。此法可分為工作曲線法及外標(biāo)一點(diǎn)法等。工作曲線法是用對(duì)照物質(zhì)配制一系列濃度的對(duì)照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。

在完全相同的條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣與對(duì)照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測組分的信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度，或用回歸方程計(jì)算，工作曲線法也可以用外標(biāo)二點(diǎn)法代替。通常截距應(yīng)為零，若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時(shí)，可用外標(biāo)一點(diǎn)法(直接比較法)定量。

外標(biāo)一點(diǎn)法是用一種濃度的對(duì)照品溶液對(duì)比測定樣品溶液中i組分的含量。將對(duì)照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進(jìn)樣，測得峰面積的平均值，用下式計(jì)算樣品中i組分的量：

W＝A(W)／(A)

式中W與A分別代表在樣品溶液進(jìn)樣體積中所含i組分的重量及相應(yīng)的峰面積。(W)及（A)分別代表在對(duì)照品溶液進(jìn)樣體積中含純品i組分的重量及相應(yīng)峰面積。外標(biāo)法方法簡便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對(duì)待測組分定量。但此法的準(zhǔn)確性受進(jìn)樣重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性的影響。此外，為了降低外標(biāo)一點(diǎn)法的實(shí)驗(yàn)誤差，應(yīng)盡量使配制的對(duì)照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。

外標(biāo)法 external standard method 色譜分析中的一種定量方法，它不是把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入到被測樣品中，而是在與被測樣品相同的色譜條件下單獨(dú)測定，把得到的色譜峰面積與被測組分的色譜峰面積進(jìn)行比較求得被測組分的含量。

外標(biāo)物與被測組分同為一種物質(zhì)但要求它有一定的純度，分析時(shí)外標(biāo)物的濃度應(yīng)與被測物濃度相接近，以利于定量分析的準(zhǔn)確性。

C_i=f_iA_i+b 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合公式，f_i -i組分工作曲線斜率

特 點(diǎn)：

1、實(shí)驗(yàn)室最常用的定量方法，定量結(jié)果較為準(zhǔn)確

2、不需要所有峰都流出或被檢測到，只對(duì)目標(biāo)組分校正

3、需要標(biāo)準(zhǔn)品

4、進(jìn)樣量必須準(zhǔn)確

5、儀器必須有良好的穩(wěn)定性

6、每個(gè)樣品分析的色譜條件（檢測器響應(yīng)性能、柱溫、流動(dòng)相組成及流速，進(jìn)樣量，柱效等）很難完全相同，因此容易出現(xiàn)較大誤差

7、對(duì)樣品前處理過程中被測組分的變化無法進(jìn)行補(bǔ)償

三、單點(diǎn)校正法

當(dāng)被測試樣中各組分濃度變化范圍不大時(shí)，可不必繪制多點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線，而采用單點(diǎn)校正法（直接比較法）。配制一個(gè)和被測組分含量接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液，定量進(jìn)樣，依據(jù)被測組分和外標(biāo)組分峰面積比或峰高比計(jì)算被測組分的含量。

W_i=f_iA_i，W_S=f_SA_S，f_i=f_S

W_i/W_S=A_i/A_S

i-被測組分；S-標(biāo)準(zhǔn)液組分

缺 點(diǎn)：

單點(diǎn)校正法實(shí)際上是利用原點(diǎn)作為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上的另一個(gè)點(diǎn)。因此，當(dāng)方法存在較大系統(tǒng)誤差時(shí)（即標(biāo)準(zhǔn)工作曲線不通過原點(diǎn)），單點(diǎn)校正法的誤差較大。

四、內(nèi)標(biāo)法

內(nèi)標(biāo)法是一種間接或相對(duì)的校準(zhǔn)方法。在分析測定樣品中某組分含量時(shí)，加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校誰和消除出于操作條件的波動(dòng)而對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。

內(nèi)標(biāo)法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)標(biāo)法時(shí)，在樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，它可被色譜拄所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾，只要測定內(nèi)標(biāo)物和待測組分的峰面積與相對(duì)響應(yīng)值，即可求出待測組分在樣品中的百分含量。采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，內(nèi)標(biāo)物的選擇是一項(xiàng)十分重要的工作。

理想地說，內(nèi)標(biāo)物應(yīng)當(dāng)是一個(gè)能得到純樣的己知化合物，這樣它能以準(zhǔn)確、已知的量加到樣品中去，它應(yīng)當(dāng)和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì)(如化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等)、色譜行為和響應(yīng)特征，最好是被分析物質(zhì)的一個(gè)同系物。

當(dāng)然，在色譜分析條什下，內(nèi)標(biāo)物必須能與樣品中各組分充分分離。需要指出的是，在少數(shù)情況下，分析人員可能比較關(guān)心化臺(tái)物在一個(gè)復(fù)雜過程中所得到的回收率，此時(shí)，他可以使用一種在這種過程中很容易被完全回收的化臺(tái)物作內(nèi)標(biāo)，來測定感興趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所說的選擇原則。

在使用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，有哪些因素會(huì)影響內(nèi)標(biāo)和被測組分的峰高或峰面積的比值?

影響內(nèi)標(biāo)和被測組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學(xué)方面的、色譜方面的和儀器方面的三類。

由化學(xué)方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時(shí)出現(xiàn)。

化學(xué)方面的因素包括：

1、內(nèi)標(biāo)物在樣品里混合不好；

2、內(nèi)標(biāo)物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng)，

3、內(nèi)標(biāo)物純度可變等。

對(duì)于一個(gè)比較成熟的方法來說，色譜方面的問題發(fā)生的可能性更大一些，色譜上常見的一些問題(如滲漏)對(duì)絕對(duì)面積的影響比較大，對(duì)面積比的影響則要小一些，但如果絕對(duì)面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有某個(gè)重要的色譜問題存在，比如進(jìn)樣量改變太大，樣品組分濃度和內(nèi)標(biāo)濃度之間有很大的差別，檢測器非線性等。進(jìn)樣量應(yīng)足夠小并保持不變，這樣才不致于造成檢測器和積分裝置飽和。

如果認(rèn)為方法比較可靠，而色譜固看來也是正常的話，應(yīng)著重檢查積分裝置和設(shè)置、斜率和峰寬定位。對(duì)積分裝置發(fā)生懷疑的最有力的證據(jù)是：面積比可變，而峰高比保持相對(duì)恒定，

在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意什么?

在用內(nèi)標(biāo)法做色話定量分析時(shí)，先配制一定重量比的被測組分和內(nèi)標(biāo)樣品的混合物做色譜分析，測量峰面積，做重量比和面積比的關(guān)系曲線，此曲線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在實(shí)際樣品分析時(shí)所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所用的條件一致，因此，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，不僅要注明色譜條件(如固定相、柱溫、載氣流速等)，還應(yīng)注明進(jìn)樣體積和內(nèi)標(biāo)物濃度。

在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，各點(diǎn)并不完全落在直線上，此時(shí)應(yīng)求出面積比和重量比的比值與其平均位的標(biāo)準(zhǔn)偏差，在使用過程中應(yīng)定期進(jìn)行單點(diǎn)校正，若所得值與平均值的偏差小于2，曲線仍可使用，若大于2，則應(yīng)重作曲線，如果曲線在鉸短時(shí)期內(nèi)即產(chǎn)生變動(dòng)，則不宜使用內(nèi)標(biāo)法定量。

內(nèi)標(biāo)法的關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標(biāo)物。

試樣配制：準(zhǔn)確稱取一定量的試樣W_i，加入一定量內(nèi)標(biāo)物W_IS

W_i=f_iA_i，W_IS=f_ISA_IS

W_i=f_iA_i/f_ISA_IS*W_IS=f_i'A_i/A_IS*W_IS

f_i'為待測組分i對(duì)內(nèi)標(biāo)物IS的質(zhì)量校正因子

將C_IS化歸為1則橫坐標(biāo)即可直接讀出目標(biāo)物濃度值C_i

特 點(diǎn)：

1、多用在國際標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)定比較嚴(yán)格的方法中

2、臨床上檢測內(nèi)源性化合物應(yīng)用較多

3、進(jìn)樣量的變化，色譜條件的微小變化對(duì)內(nèi)標(biāo)法定量結(jié)果影響不大

4、樣品前處理（如濃縮、萃取，衍生化等）前加入內(nèi)標(biāo)物，可部分補(bǔ)償被測組分樣品前處理過程的損失

5、樣品中必須加入等量的同一內(nèi)標(biāo)物

6、操作相對(duì)繁瑣

7、內(nèi)標(biāo)物的選擇較困難

內(nèi)標(biāo)物選擇：

1、樣品中不存在且理化性質(zhì)與待測物一致

2、不與樣品中組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)

3、內(nèi)標(biāo)物與待測物響應(yīng)相近

4、內(nèi)標(biāo)物與待測物既能較好的分離，又不相距太遠(yuǎn)（質(zhì)譜法同位素內(nèi)標(biāo)物除外）

5、內(nèi)標(biāo)物與待測物峰面積比在0.7-1.3范圍內(nèi)最好（根據(jù)待測物濃度確定內(nèi)標(biāo)物的添加量）

6、常用的內(nèi)標(biāo)物有同系物以及質(zhì)譜法常用的同位素內(nèi)標(biāo)物如氘代內(nèi)標(biāo)

五、標(biāo)準(zhǔn)加入法

標(biāo)準(zhǔn)加入法可以看作是內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法的結(jié)合。當(dāng)選擇不到合適的內(nèi)標(biāo)物或無空白樣品時(shí)，以待測組分的純物質(zhì)為內(nèi)標(biāo)物加入到待測樣品中，然后在相同的色譜條件下，測定加入待測組分純物質(zhì)前后的峰面積（或峰高），從而計(jì)算待測組分在樣品中含量的方法。

具體操作是取等量待測樣品若干份，加入不同濃度的待測組分的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。工作曲線延長線在橫坐標(biāo)上的截距即為樣品中待測組分的濃度。由于待測組分以及加入的標(biāo)準(zhǔn)溶液處在相同的樣品基體中，相當(dāng)于把待測試樣作為了背景值。

但是，由于對(duì)每一個(gè)樣品都要配制三個(gè)以上的、含樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的混合溶液，因此，這種方法不適于大批樣品的分析。

W_i+W_添加=f_i'A_i'

當(dāng)f_i=f_i'時(shí)，(W_i+ W_添加)/W_i=A_i'/A_i，即W_i= W_添加/(A_i'/A_i-1)

特 點(diǎn)：

1、只需欲測組分的純物質(zhì)，不需另外選擇內(nèi)標(biāo)物

2、進(jìn)樣量要準(zhǔn)確

3、兩次色譜條件完全相同以保證校正因子完全相等

4、若在樣品的前處理之前就加入已知準(zhǔn)確量的待測組分，則可以補(bǔ)償欲測組分在前處理過程中的損失，是色譜分析中較常用的定量分析方法

5、缺點(diǎn)是要求加入待測組分前后兩次色譜條件完全相同，以保證兩次測定時(shí)的校正因子完全相等，否則將引起分析測定的誤差

應(yīng)用外標(biāo)法能夠滿足要求，首選外標(biāo)法，畢竟外標(biāo)法簡單省事。單從精密度方面去考慮，排除其它成本和效率的因素，內(nèi)標(biāo)法優(yōu)于外標(biāo)法。對(duì)結(jié)果精密度和準(zhǔn)確度要求高時(shí)采用內(nèi)標(biāo)法還是必要的。

內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都是定量的一種方法，各有優(yōu)缺點(diǎn)，要綜合考慮分析領(lǐng)域，分析要求和以及分析成本和分析效率等方面來選擇定量方法，找到簡單而有效的定量分析法才是最重要的。