肽分離初學(xué)者指南

簡介

肽在新型候選藥物的開發(fā)中發(fā)揮著特有的作用，填補(bǔ)了傳統(tǒng)小分子治療藥物與大分子蛋白質(zhì)治療藥物之間的專業(yè)技術(shù)空白。肽類藥物的療效和安全性均優(yōu)于小分子藥物，在人體內(nèi)的耐受性也更高，此外，其工藝復(fù)雜性和生產(chǎn)成本低于蛋白質(zhì)類生物藥物，作為一種有望應(yīng)用于治療多種疾病的候選藥物，肽類藥物受到越來越多的關(guān)注。合成肽可用于研究細(xì)胞基質(zhì)間的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系，其本身也是具有療效的藥物。無論是采用固相肽合成工藝、溶液相肽合成工藝，還是從天然產(chǎn)物中分離，幾乎所有粗制肽混合物都相當(dāng)復(fù)雜且需要進(jìn)行純化。即使小心控制合成反應(yīng)，也會不可避免地形成雜質(zhì)，產(chǎn)物中還可能含有結(jié)構(gòu)缺失、截斷或序列經(jīng)過化學(xué)改性的變體（如裂解加合物或處理過程中形成的其它副產(chǎn)物）。

近年來，分析方法方面的技術(shù)進(jìn)步對肽作為診斷技術(shù)和新興治療藥物的應(yīng)用起到了推動作用。采用先進(jìn)的儀器運(yùn)行分析方法可有效提高靈敏度和分離度并縮短運(yùn)行時間，這些優(yōu)勢均有助于我們在生產(chǎn)過程中節(jié)省大量時間。

有關(guān)合成肽的一大棘手問題是分離方法的開發(fā)。進(jìn)行深入研究時，純度和目標(biāo)肽收率是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素。如前文所述，合成肽在合成、裂解和去保護(hù)過程中可能會產(chǎn)生數(shù)量相當(dāng)多的雜質(zhì)。應(yīng)用分析級HPLC的方法開發(fā)原理可改善肽產(chǎn)物的分離效果。開發(fā)制備級純化方法運(yùn)用的分離機(jī)制與開發(fā)小規(guī)模方法時需遵循的原則相同。色譜柱和流動相改性劑的選擇、溫度控制以及梯度優(yōu)化是開發(fā)任何分離方法時都必須考察的內(nèi)容。通過系統(tǒng)方法開發(fā)流程開發(fā)肽分離方法可顯著提高產(chǎn)物純度和收率。傳統(tǒng)的肽分離通常采用UV引導(dǎo)的色譜方法，而將質(zhì)譜引導(dǎo)的分離方法與嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆椒ㄩ_發(fā)流程相結(jié)合，可以更加明確地區(qū)分目標(biāo)肽與合成及裂解過程中形成的污染物，從而使純化過程變得更加輕松。

肽純化過程的要求

任何分離策略的目標(biāo)都是盡可能在盡可能短的時間內(nèi)純化盡可能多的樣品，同時達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)所要求的純度。對于需要合成多種肽的典型實(shí)驗(yàn)室而言，制定適用于大部分樣品并且可根據(jù)需要進(jìn)行簡單優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)純化方案將十分有用。若能在改變流動相組成、改性劑或柱溫時確保運(yùn)行間的性能保持一致，將省去設(shè)置多組色譜柱的時間。這種提高收率和純度的方式即經(jīng)濟(jì)又直接，且易于實(shí)施。理想肽純化方案還會使用能夠執(zhí)行分析級和制備級分離的穩(wěn)定儀器。對于流速范圍較廣的通用型儀器，僅通過改用直徑匹配分離目標(biāo)的色譜柱就能提高純化效率。綜合考量上述各因素可降低肽純化的整體成本。

肽分離工作流程

肽分離標(biāo)準(zhǔn)方案（圖1）的第一步是確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求達(dá)到的肽純度。通過粗制肽分析可合理估算樣品純度，結(jié)合該結(jié)果與后續(xù)研究所需的純肽量即可估算出載樣量。載樣量將決定制備色譜柱的規(guī)格，繼而會決定選定LC儀器的流速。

 

圖1：肽分離工作流程。

粗制肽分析完成之后的步驟是將方法幾何放大至具有相同填料的大規(guī)格色譜柱上用于分離。圖2中的放大公式展示了在不同規(guī)格色譜柱之間轉(zhuǎn)換分離方法時，色譜柱直徑、柱長、載樣量和流速之間的關(guān)系。梯度斜率表示為單位柱體積對應(yīng)的溶劑變化百分比，而非單位時間內(nèi)溶劑變化的百分比，可確保梯度方法從初始條件到最終條件的各個步驟輸送的柱體積數(shù)量始終相同，從而保持分離度一致。制備級方法必須包括一段用于模擬系統(tǒng)延遲的起始條件保持時間，具體將通過小規(guī)模分離確定，同樣以柱體積數(shù)量表示。

制備型色譜分離完成后，將對收集到的餾分進(jìn)行分析評估。純肽的后續(xù)處理應(yīng)遵循用戶指南。

 

圖2：放大公式。

肽分離完全可以采用配備泵、進(jìn)樣器、UV檢測器和餾分收集器的簡單液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行（圖3）。雖然并不是肽分離必須采用的技術(shù)，但質(zhì)譜檢測可鑒定目標(biāo)肽并減少分離之后需要進(jìn)行分析的餾分?jǐn)?shù)量。無法電離或難電離的化合物通常采用短波長UV檢測。相反，UV吸光性極差的肽通常可由MS輕松檢出。

 

圖3：液相色譜系統(tǒng)基本組成示意圖。

純化過程注意事項(xiàng)

分離模式

由于不同肽的特性各異，分離可用的色譜模式也有許多選擇。盡管反相色譜是目前應(yīng)用非常廣的肽分離模式，但使用離子交換色譜或體積排阻色譜等替代選擇方法來分離某些肽會更加高效。這些替代技術(shù)也可與反相色譜聯(lián)用，制定專用于棘手樣品的兩步分離方案。

反相色譜

反相色譜因其重現(xiàn)性好、適用性廣的優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于多種類型化合物的分離，其中也包括肽的分離。非極性的C18-鍵合硅膠是最常用的一類反相色譜柱填料。反相色譜流動相通常由水和可與水混溶的極性有機(jī)溶劑（例如乙腈或甲醇）組成，這種流動相會根據(jù)化合物極性從C18色譜柱上洗脫化合物。因此，肽本身的疏水性越強(qiáng)，它在C18色譜柱上的保留性就越好。雖然C18是最常用的反相填料，但其它一些鍵合相（C4、C8、RP18、苯基等）也可與基質(zhì)顆粒鍵合，為優(yōu)化化合物分離提供替代選擇性。硅膠是最早問世的反相色譜柱填料之一，但硅膠基填料會限制分離速度、分離度、pH、溫度耐受性以及色譜柱載樣量。采用獲專利的*雜化顆粒技術(shù)開發(fā)的新型色譜柱基質(zhì)顆粒能夠在更高的流速、溫度和pH下運(yùn)行，同時提高選擇性、分離度、重現(xiàn)性并延長色譜柱壽命。

*美國專利號6,686,035 B2

離子交換色譜

離子交換色譜從很早開始就被用于蛋白質(zhì)及其它生物制劑的分離。由于組成肽的氨基酸帶有正電或負(fù)電，因此可采用離子交換色譜進(jìn)行肽分離。經(jīng)過官能化的天然聚合物樹脂（如瓊脂糖）和合成聚合物（如聚甲基丙烯酸甲酯(MMA)，或苯乙烯-二乙烯苯共聚物）是大分子分離的常用介質(zhì)，這些填料可承受大規(guī)模生物處理的工藝周期和批次之間極為嚴(yán)苛的清潔處理。上述工藝采用的氫氧化鈉溶液會損壞小分子和小規(guī)模肽分離常用的硅膠基填料。

離子交換劑可分為四種：弱陰離子、弱陽離子、強(qiáng)陰離子和強(qiáng)陽離子交換劑。陽離子交換模式用于保留并分離帶負(fù)電表面上的正電荷離子，而陰離子交換模式則用于保留并分離帶正電表面上的負(fù)電荷離子。強(qiáng)陰離子和強(qiáng)陽離子交換色譜柱可在較寬的pH范圍內(nèi)(2~12)完全離子化，而弱離子交換色譜柱只能在較窄的pH范圍內(nèi)(9.5~5.5)離子化。

相較于陰離子交換模式，陽離子交換模式更常用于肽分離，但具體選用哪種模式取決于肽序列。在pH小于3的條件下進(jìn)行肽分離時，氨基酸側(cè)鏈羧基上的負(fù)電將被中和，同時N-端基團(tuán)質(zhì)子化，使得肽帶上正電荷，進(jìn)而被吸引至陽離子交換色譜柱上的負(fù)電位點(diǎn)（圖4）。反之，對于適合在pH 6~10的條件下進(jìn)行分離的肽，應(yīng)采用陰離子交換模式。在較高pH條件下進(jìn)行陰離子交換時，肽上的羧基帶負(fù)電，因此會被吸引至陰離子交換色譜柱上的正電位點(diǎn)（圖5）。

 

圖4：肽被陽離子交換色譜柱填料吸引。

 

圖5：肽被陰離子交換色譜柱填料吸引。

為應(yīng)用離子交換技術(shù)的肽分離方法選擇色譜柱和進(jìn)行方法開發(fā)時，應(yīng)遵循幾條一般建議。陰離子和陽離子交換模式均可使用，基本原則是：分離酸性肽采用陰離子交換模式，分離堿性肽采用陽離子交換模式。對于某些肽，可能需要反向運(yùn)用該原則（尤其是分子量較大的肽），但必須通過調(diào)節(jié)pH使肽所帶的凈電荷與填料所帶的電荷相反。

無論極性如何，強(qiáng)交換劑都是肽色譜分離的理想選擇。肽的帶電情況是序列和帶電側(cè)鏈所處微環(huán)境共同作用的結(jié)果。針對具體的肽序列，可通過小幅調(diào)整流動相pH來調(diào)節(jié)分離的選擇性。選擇性的小幅調(diào)整不會影響強(qiáng)離子交換劑的結(jié)合能力。

離子交換分離是作為兩步純化方案中的第一步還是作為單步分離方案用于制備實(shí)驗(yàn)材料，會影響流動相和操作條件的選擇。如果離子交換分離的產(chǎn)物將通過反相色譜進(jìn)一步純化，則可以采用常用蛋白質(zhì)離子交換方案的緩沖液和洗脫條件，例如使用磷酸鹽或Tris緩沖液并采用氯化鈉梯度進(jìn)行洗脫。產(chǎn)物中的鹽將通過后續(xù)步驟去除。

如果要通過離子交換法一步得到可用的肽，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇可通過凍干去除的揮發(fā)性緩沖液。甲酸銨是最佳選擇，因?yàn)樗哂蟹謩e對應(yīng)銨鹽和甲酸鹽pK值的兩個緩沖區(qū)域。甲酸銨既可在pH 3~4的條件下用于堿性肽的陽離子交換色譜分離，又可在pH 9.25~10.25的條件用于酸性肽的陰離子交換色譜分離。在pH恒定的條件下，可利用甲酸銨濃度逐漸升高的離子強(qiáng)度梯度來洗脫目標(biāo)肽。另一方面，利用pH梯度進(jìn)行洗脫則能夠省去通過凍干去除高離子強(qiáng)度緩沖液的耗時操作。同樣地，甲酸銨緩沖液是很好的起始緩沖液。采用陰離子交換劑分離酸性肽時的洗脫梯度為pH從高到低，采用陽離子交換劑分離堿性肽時的洗脫梯度則為pH從低到高。

體積排阻色譜
根據(jù)分子大小進(jìn)行色譜分離的技術(shù)如今被稱為體積排阻色譜(SEC)，該技術(shù)可追溯至二十世紀(jì)五十年代。這種分離技術(shù)基于分子大小進(jìn)行色譜分離，而非基于分子的帶電情況或極性等化學(xué)特性，過去也被稱作凝膠過濾或凝膠滲透色譜(GPC)。具有特定孔徑分布的固定相顆粒可阻止大于柱床孔穴的樣品分子進(jìn)入，從而使其快速被洗脫，小分子則會進(jìn)入孔穴中并深入更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，洗脫速度較慢。因此，大分子最先洗脫，小分子則根據(jù)其在溶液中的大小以降序順序洗脫出來（圖6）。SEC是一種低分離度技術(shù)，采用等度方法且運(yùn)行之間無需進(jìn)行平衡。色譜柱上樣量取決于樣品體積和濃度，而這兩個因素都會影響分離度。

 

圖6：體積排阻色譜樣品洗脫過程。

SEC有時會作為初始凈化步驟用于去除截斷序列、去保護(hù)不徹底的肽以及其它雜質(zhì)。隨著合成肽的序列長度增加，上述污染物的數(shù)量也會大幅增加。在反相分離之前執(zhí)行任何簡單的初始純化步驟都有助于簡化色譜分離。SEC還可用于緩沖液更換，也就是將當(dāng)前溶解肽的緩沖液更換為更適合后續(xù)實(shí)驗(yàn)或純化步驟的其它緩沖液或溶液。

總結(jié)

肽分析和分離可采用多種不同的色譜技術(shù)，包括反相色譜、離子交換色譜和體積排阻色譜。半制備級分離（分離量為幾毫克至幾百毫克）通常采用反相色譜技術(shù)。本文后續(xù)部分將圍繞肽分離展開，重點(diǎn)介紹可利用哪些相關(guān)因素和技術(shù)對應(yīng)用反相色譜分析和純化肽的方法進(jìn)行優(yōu)化。